Skip to content

Choroba Hodgkina z monoklonalnymi i poliklonalnymi populacjami komórek Reeda-Sternberga ad

1 tydzień ago

471 words

Hybrydyzację in situ z sondami do jądrowego RNA i 2 kodowanego EBV (EBER i 2) przeprowadzono w sposób opisany w innym miejscu. 26 Określono liczbę komórek Reeda-Sternberga pozytywnych pod względem CD30 spośród 2000 komórek innych typów. Indeks mitotyczny komórek Reeda-Sternberga badano przez zliczenie liczby mitotycznych postaci w 300 komórkach Reeda-Sternberga pozytywnych pod względem CD30. Izolacja pojedynczych komórek
Figura 1. Figura 1. Izolacja pojedynczej komórki Reed-Sternberg z dodatnim CD30 z odcinka tkanki od pacjenta z ziarnicą złośliwą (x 600). Sekcja tkanki pokazana jest wcześniej (panel A), a po (panel B) izolacja komórki. Wybarwione immunologicznie komórki Reeda-Sternberga odcięto od otaczających komórek za pomocą kapilary manipulacyjnej (MC) i przeniesiono do kapilary odbiorczej (RC) bez uszkodzenia otaczających komórek i tkanki, jak opisali Küppers i wsp.25.
Zamrożone sekcje o grubości 7 .m były wybarwione immunologicznie dla CD30, CD20 lub TCR.. Oprócz 5 komórek CD20-dodatnich i 5 komórek TCR.-dodatnich wykorzystywanych jako kontrola, z każdej próbki izolowano co najmniej 20 komórek Reeda-Sternberga pozytywnych pod względem CD30 i zbierano w sposób opisany przez Küppers et al. (Figura 1A i Figura 1B) .25 Wszystkie izolacje komórek przeprowadzono co najmniej dwukrotnie przez różne osoby.
Reakcja łańcuchowa polimerazy
Przeprowadzono zagnieżdżoną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z konsensusowymi starterami FR127 i LJH28 w pierwszej rundzie amplifikacji i konsensusowymi starterami FR2A i VLJH do reamplifikacji28.
Pierwszy PCR przeprowadzono w probówce, do której przeniesiono pojedynczą komórkę, z 300 ng starterów FR1 (po 50 ng), 75 ng podkładu LJH i 2,5 mmol chlorku magnezu na litr roztworu w całkowitej objętości 100 .l. PCR obejmował 5 cykli w temperaturze 63 ° C i 35 cykli w temperaturze 57 ° C w celu wyżarzania starterów. Próbkę 1% pierwszego produktu amplifikacji użyto jako matrycę do reamplifikacji, z 200 ng FR2A, 400 ng VLJH i 1,5 mmol chlorku magnezu na litr roztworu. Drugi PCR składał się z 40 cykli w 63 ° C. Wszystkie inne warunki PCR były takie same, jak opisano wcześniej. 29, 30
Sześć mikrolitrów każdego produktu amplifikacji poddano elektroforezie w żelu poliakryloamidowym, a następnie wybarwiono bromkiem etydyny.
Analiza sekwencji DNA
Izolację zamplifikowanych produktów i późniejszą analizę sekwencji DNA przeprowadzono w sposób opisany w innym miejscu30. Uzyskane sekwencje porównano ze sobą i z opublikowanymi sekwencjami linii zarodkowych immunoglobulin łańcucha ciężkiego zmiennego regionu (Vh) (GenBank, uwalnianie 87) i przetłumaczone na białko. Sekwencje z podstawieniami więcej niż trzech zasad uznano za zmutowane somatycznie, ponieważ w sekwencjach Vh linii zarodkowej występuje bardzo niewielki polimorfizm.
Wyniki
Eksperymenty kontrolne
Figura 2. Figura 2. Produkty amplifikacji genów VH generowanych przez PCR z użyciem starterów FR2A i VLJH. Panel A pokazuje produkty amplifikacji po 6% elektroforezie w żelu poliakryloamidowym i barwieniu bromkiem etydyny. Produkty pochodziły z pojedynczych wybranych normalnych komórek B (ścieżki do 4) i preparatów cytospinowych pojedynczych komórek z linii komórkowej Raji (ścieżki 9 i 10)
[więcej w: gościec stawowy objawy, ból kości jarzmowej, przychodnia na batorego ]

Powiązane tematy z artykułem: ból kości jarzmowej gościec stawowy objawy przychodnia na batorego